帕米尔红景天中对羟基苯乙酮成分的提取分离及其含量测定*
作者：开丽曼 李俐 阿合买提江 堵年生
单位：新疆医科大学药学院 乌鲁木齐830054
关键词：帕米尔红景天；对羟基苯乙酮；双波长薄层扫描法
摘 要 从帕米尔红景天中提取分离得到高含量的羟基苯乙酮摘 要 从帕米尔红景天中提取分离得到高含量的羟基苯乙酮，经UR、IR、1H-NMR和13C-NMR等光谱方法确定了它的结构。并以其作为对照品，用双波长薄层扫描方法测定其在药材中的含量，薄层分离条件为石油醚∶乙酸乙酯(6∶4)展开，测定波长λS为280nm，参比波长λR为235nm，平均回收率为98.0%，RSD=1.4%，稳定性和精密度均满足要求，可作为开发帕米尔红景天资源的质量控制标准。
Abstraction and Assaying of p-Hydroxyacetophenone from Rhodiola Pamiro-alaica A.Bor
, 百拇医药
Kai Liman, Li Li, Ahemaitijang， Du Niansheng
College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Ulumuqi 830054, P.R.China
ABSTRACT p-Hydroxyacetophenone was obtained from extracts of roots of Rhodiola pamiro-alaica A.Bor. extracted with 95% EtOH. Its structure was identified by modern analysis methods such as UV, IR, ?H-NMR, and 13C-NMR. It was a main constituent and may be separated on silica gel plate with petroleumether: EtOAc(6∶4). The spots were scanned with Shimadzu CS-930 dual wavelength TLC Scanner. λS=280 nm, λR=230 nm. The average recovery was 98.0%(n=5), RSD=2.1%. The stability of p-Hydroxyacetophenone spots and the precision of the above-mentioned method were found to be satisfactory.
, 百拇医药
KEY WORDS Rhodiola pamiro-alaica; p-Hydroxyacetophenone; Dual wavelength TLC scanning method
帕米尔红景天(Phodiola pamiro-alaica A.Bor)(PPA)系景天科红景天属植物，以根或全草入药，主要生长在新疆西南部的帕米尔高原。前苏联学者对其药理作用研究较多，认为它有抗缺氧，抗疲劳，抗辐射和有类似人参的适应原样作用[1]，是航天医学、运动医学、抗衰老医学和军事医学的研究热点。其主要有效成分通常认为是红景天甙和酪醇[2]，但生长在高海拔、高寒和强紫外线照射的PPA中却未曾提取到上述成分，而实际上提取到的大量与之结构相类似的是对羟基苯乙酮(p-Hydroxyacetophenone，p-HAP)，其碳架均属于苯乙基类，表现出同属植物中化学结构上的相似性。p-HAP具有利胆、保肝和抗病毒等多方面的功能[2]，研究它的提取分离、结构鉴定及其含量测定的方法，将有助于开发帕米尔红景天植物资源。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 仪器及试剂
UV-365型紫外分光光度计(岛津)；260-50型红外分光光度计(日立)；INOVA500MHz、NMR仪(Rruker)；CS-930型双波长薄层扫描仪(岛津)；微量定量毛细管(Drummond科学公司)；硅胶GF254薄层板(青岛海洋化工厂)；DR-1型数据处理机(岛津)；PPA采自新疆红旗拉甫，经新疆药物研究所张彦福研究员鉴定。试剂均为AR级。
1.2 提取分离及结构鉴定
帕米尔红景天根粗粉1kg，用95%乙醇提取3次，浓缩提取液至稠膏状，用少量水混悬，用乙酸乙酯萃取混悬液，浓缩乙酸乙酯萃取液，所得稠膏用硅酸进行柱层分离，用石油醚乙酸乙酯(9∶1～1∶9)进行梯度洗脱，共分及11个化合物。其中7∶3洗脱体积约1500ml，后900ml浓缩后析出针状结晶，经丙酮重结晶后测熔点为107～108℃，与文献报道的对羟基苯乙酮熔点一致[3]，UVλ?EtOHmax(nm)：277；IR(KBr)(cm-1)：3500～3100(OH)，1650，1600，1580(芳环)，840(对位取代)；FAB-MSm/e:137(M+H),′H-NMR(acetone-d6)δppm：2.44(S，3H，CH3)，6.86和7.84(each2H,AA′BB′,J邻=9H2，3、5-Ar-H和2、6-Ar-H)，13C-NMR(acetone-d6)δppm：26.7(CH3)，116.5(C-2，C-6)，131.0(C-3，C-5)，131.9(C-4)，163.1(C-1),196.7(C=0)。根据以上光谱数据与文献值[2]核对，鉴定该化合物为对羟基苯乙酮。
, 百拇医药
1.3 双波长薄层扫描法测定PPA中p-HAP的含量
1.3.1 薄层色谱分离条件
薄层板于105℃活化30min，密存备用，点样品液于硅胶GF254薄层板上，以石油醚∶乙酸乙酯(6∶4)为展开剂，在温度20±2℃的条件下展开，色谱分离结果表明，样品中对羟基苯乙酮的分离较为理想(图1)。
图1 薄层色谱扫描图
1.3.2 测定波长的确定
点p-HAP标准品5μg(1.0μg.L-1甲醇液)于薄板上，展开10cm，在薄层扫描仪上于200～370nm波长范围内，进行背景光谱扫描及p-HAP斑点差示光谱扫描，得到吸收光谱(见图2)。测定波长λS为280nm，参比波长λR为235nm。
, 百拇医药
1.对羟基苯乙酮对照品2.薄层板背景
图2 紫外吸收光谱图
1.3.3 稳定性考察
同前点样，展开，将薄层板取出凉干30min，在选定波长下，采用双波长反外法锯齿形扫描，扫描宽度10mm，狭缝1.2mm×0.2mm，线性参数SX＝7，对斑点每隔20min重复扫描测定，持续4h，积分值不变，RSD为1.1%，表明斑点较稳定。
1.3.4 精密度试验
在同一块薄板上，精密点标准溶液5点，共点5块板，展开后测定积分值，得板内及板间精密度分别为1.4%和2.3%。结果表明可用回归曲线定量法进行样品测定。
1.3.5 线性范围和回归方程
, 百拇医药
用微量定量毛细管吸取p-HAP标准液2.0～0.6μl，点样4个斑点。按照上述方法操作，以积分值及样量点计算得回归方程为：A=-0.867+0.538c，r=0.999，p-HAP在2.0～6.0μg范围内与积分值呈线性关系。
2 结果与讨论
2.1 样品测定
精密称取PPA根茎20.0g，置沙氏提取器上，用甲醇回流8h，浓缩提取液，加300ml蒸馏水混悬，用乙酸乙酯萃取3次，每次100ml，合并萃取液，回收乙酸乙酯。浓缩物用乙酸乙酯定容至50.0ml，即得样品测定液。将样品液3.0μl，对照品2.0μl和5.0μl点在同一块薄板上，按稳定性试验项下的方法操作，外标二点法定量，测得样品的含量见表1。
表1 样品分析结果
序 号
, 百拇医药
1
2
3
4
5
百分含量(%)
0.709
0.683
0.692
0.694
0.701
平均含量(%)
0.696
, 百拇医药
RSD(%)
1.4
2.2 回收率试验
精密称取p-HAP10.0mg，与10.0mlPPA样品液混匀，得回收溶液。将回收溶液2.0μl，对照品2.0μl和5.0μl，点在同一块薄板上，按稳定性试验项下的方法操作，外标二点法定量。测得数据见表2。表2 回收结果
序号
加入量
(mg)
回收量
(mg)
回收率
, http://www.100md.com
(%)
平均回收率
(%)
RSD
(%)
1
10.00
9.59
95.9
2
10.00
9.74
97.4
, 百拇医药
3
10.00
9.98
99.8
98.0
2.1
4
10.00
10.04
100.4
5
10.00
9.64
, 百拇医药
96.4
2.3 讨 论
有关红景天化学成分研究的报道很多，但未见到有关PPA化学成分的揭示。本文首次报道其中主要高含量成分――p-HAP的提取分离方法及结构鉴定数据。因为含量高，不用色层分离而用经典的溶剂分离也可得到高纯度的p-HAP，方法用热乙醇回流提取药材，制得总浸膏，以乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩至稠膏状，以甲醇热溶，活性炭脱色，放置析晶，若纯度不好，反复重结晶，可得纯晶。
PPA采于新疆红旗拉甫，海拔高度为4500m以上，文献资料表明[3]，红景天甙和酪醇含量与红景天植物生长海拔高度有关，海拔越高含量越低，我们目前已从PPA中得到8种化合物(另文报道)，未发现红景天甙和酪醇的结构，结果也与文献报道吻合。
本文选择p-HAP紫外光谱最大吸收峰值作为测定波长λS，与该波长对应和背景等吸收点波长作为参比波长λR，采用双波长薄层扫描法可同时消除薄层板厚度不均的背景吸收所带来的误差。本课题由国家自然科学基金会资助
参考文献
1 王曙，王峰鹏.红景天植物化学成分研究概述.天然产物研究与开发，1991，4(3)：58～65
2 江纪武.植物药有效成分手册.北京：人民卫生出版社.1986.584
3 王曙.红景天属植物中红景天甙的高效液相色谱分析.药学学报，1992，27(11)：849～852
(1998-11-03收稿 19990524修回), 百拇医药
单位：新疆医科大学药学院 乌鲁木齐830054
关键词：帕米尔红景天；对羟基苯乙酮；双波长薄层扫描法
摘 要 从帕米尔红景天中提取分离得到高含量的羟基苯乙酮摘 要 从帕米尔红景天中提取分离得到高含量的羟基苯乙酮，经UR、IR、1H-NMR和13C-NMR等光谱方法确定了它的结构。并以其作为对照品，用双波长薄层扫描方法测定其在药材中的含量，薄层分离条件为石油醚∶乙酸乙酯(6∶4)展开，测定波长λS为280nm，参比波长λR为235nm，平均回收率为98.0%，RSD=1.4%，稳定性和精密度均满足要求，可作为开发帕米尔红景天资源的质量控制标准。
Abstraction and Assaying of p-Hydroxyacetophenone from Rhodiola Pamiro-alaica A.Bor
, 百拇医药
Kai Liman, Li Li, Ahemaitijang， Du Niansheng
College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Ulumuqi 830054, P.R.China
ABSTRACT p-Hydroxyacetophenone was obtained from extracts of roots of Rhodiola pamiro-alaica A.Bor. extracted with 95% EtOH. Its structure was identified by modern analysis methods such as UV, IR, ?H-NMR, and 13C-NMR. It was a main constituent and may be separated on silica gel plate with petroleumether: EtOAc(6∶4). The spots were scanned with Shimadzu CS-930 dual wavelength TLC Scanner. λS=280 nm, λR=230 nm. The average recovery was 98.0%(n=5), RSD=2.1%. The stability of p-Hydroxyacetophenone spots and the precision of the above-mentioned method were found to be satisfactory.
, 百拇医药
KEY WORDS Rhodiola pamiro-alaica; p-Hydroxyacetophenone; Dual wavelength TLC scanning method
帕米尔红景天(Phodiola pamiro-alaica A.Bor)(PPA)系景天科红景天属植物，以根或全草入药，主要生长在新疆西南部的帕米尔高原。前苏联学者对其药理作用研究较多，认为它有抗缺氧，抗疲劳，抗辐射和有类似人参的适应原样作用[1]，是航天医学、运动医学、抗衰老医学和军事医学的研究热点。其主要有效成分通常认为是红景天甙和酪醇[2]，但生长在高海拔、高寒和强紫外线照射的PPA中却未曾提取到上述成分，而实际上提取到的大量与之结构相类似的是对羟基苯乙酮(p-Hydroxyacetophenone，p-HAP)，其碳架均属于苯乙基类，表现出同属植物中化学结构上的相似性。p-HAP具有利胆、保肝和抗病毒等多方面的功能[2]，研究它的提取分离、结构鉴定及其含量测定的方法，将有助于开发帕米尔红景天植物资源。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 仪器及试剂
UV-365型紫外分光光度计(岛津)；260-50型红外分光光度计(日立)；INOVA500MHz、NMR仪(Rruker)；CS-930型双波长薄层扫描仪(岛津)；微量定量毛细管(Drummond科学公司)；硅胶GF254薄层板(青岛海洋化工厂)；DR-1型数据处理机(岛津)；PPA采自新疆红旗拉甫，经新疆药物研究所张彦福研究员鉴定。试剂均为AR级。
1.2 提取分离及结构鉴定
帕米尔红景天根粗粉1kg，用95%乙醇提取3次，浓缩提取液至稠膏状，用少量水混悬，用乙酸乙酯萃取混悬液，浓缩乙酸乙酯萃取液，所得稠膏用硅酸进行柱层分离，用石油醚乙酸乙酯(9∶1～1∶9)进行梯度洗脱，共分及11个化合物。其中7∶3洗脱体积约1500ml，后900ml浓缩后析出针状结晶，经丙酮重结晶后测熔点为107～108℃，与文献报道的对羟基苯乙酮熔点一致[3]，UVλ?EtOHmax(nm)：277；IR(KBr)(cm-1)：3500～3100(OH)，1650，1600，1580(芳环)，840(对位取代)；FAB-MSm/e:137(M+H),′H-NMR(acetone-d6)δppm：2.44(S，3H，CH3)，6.86和7.84(each2H,AA′BB′,J邻=9H2，3、5-Ar-H和2、6-Ar-H)，13C-NMR(acetone-d6)δppm：26.7(CH3)，116.5(C-2，C-6)，131.0(C-3，C-5)，131.9(C-4)，163.1(C-1),196.7(C=0)。根据以上光谱数据与文献值[2]核对，鉴定该化合物为对羟基苯乙酮。
, 百拇医药
1.3 双波长薄层扫描法测定PPA中p-HAP的含量
1.3.1 薄层色谱分离条件
薄层板于105℃活化30min，密存备用，点样品液于硅胶GF254薄层板上，以石油醚∶乙酸乙酯(6∶4)为展开剂，在温度20±2℃的条件下展开，色谱分离结果表明，样品中对羟基苯乙酮的分离较为理想(图1)。
图1 薄层色谱扫描图
1.3.2 测定波长的确定
点p-HAP标准品5μg(1.0μg.L-1甲醇液)于薄板上，展开10cm，在薄层扫描仪上于200～370nm波长范围内，进行背景光谱扫描及p-HAP斑点差示光谱扫描，得到吸收光谱(见图2)。测定波长λS为280nm，参比波长λR为235nm。
, 百拇医药
1.对羟基苯乙酮对照品2.薄层板背景
图2 紫外吸收光谱图
1.3.3 稳定性考察
同前点样，展开，将薄层板取出凉干30min，在选定波长下，采用双波长反外法锯齿形扫描，扫描宽度10mm，狭缝1.2mm×0.2mm，线性参数SX＝7，对斑点每隔20min重复扫描测定，持续4h，积分值不变，RSD为1.1%，表明斑点较稳定。
1.3.4 精密度试验
在同一块薄板上，精密点标准溶液5点，共点5块板，展开后测定积分值，得板内及板间精密度分别为1.4%和2.3%。结果表明可用回归曲线定量法进行样品测定。
1.3.5 线性范围和回归方程
, 百拇医药
用微量定量毛细管吸取p-HAP标准液2.0～0.6μl，点样4个斑点。按照上述方法操作，以积分值及样量点计算得回归方程为：A=-0.867+0.538c，r=0.999，p-HAP在2.0～6.0μg范围内与积分值呈线性关系。
2 结果与讨论
2.1 样品测定
精密称取PPA根茎20.0g，置沙氏提取器上，用甲醇回流8h，浓缩提取液，加300ml蒸馏水混悬，用乙酸乙酯萃取3次，每次100ml，合并萃取液，回收乙酸乙酯。浓缩物用乙酸乙酯定容至50.0ml，即得样品测定液。将样品液3.0μl，对照品2.0μl和5.0μl点在同一块薄板上，按稳定性试验项下的方法操作，外标二点法定量，测得样品的含量见表1。
表1 样品分析结果
序 号
, 百拇医药
1
2
3
4
5
百分含量(%)
0.709
0.683
0.692
0.694
0.701
平均含量(%)
0.696
, 百拇医药
RSD(%)
1.4
2.2 回收率试验
精密称取p-HAP10.0mg，与10.0mlPPA样品液混匀，得回收溶液。将回收溶液2.0μl，对照品2.0μl和5.0μl，点在同一块薄板上，按稳定性试验项下的方法操作，外标二点法定量。测得数据见表2。表2 回收结果
序号
加入量
(mg)
回收量
(mg)
回收率
, http://www.100md.com
(%)
平均回收率
(%)
RSD
(%)
1
10.00
9.59
95.9
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10.00
9.74
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, 百拇医药
3
10.00
9.98
99.8
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10.00
10.04
100.4
5
10.00
9.64
, 百拇医药
96.4
2.3 讨 论
有关红景天化学成分研究的报道很多，但未见到有关PPA化学成分的揭示。本文首次报道其中主要高含量成分――p-HAP的提取分离方法及结构鉴定数据。因为含量高，不用色层分离而用经典的溶剂分离也可得到高纯度的p-HAP，方法用热乙醇回流提取药材，制得总浸膏，以乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩至稠膏状，以甲醇热溶，活性炭脱色，放置析晶，若纯度不好，反复重结晶，可得纯晶。
PPA采于新疆红旗拉甫，海拔高度为4500m以上，文献资料表明[3]，红景天甙和酪醇含量与红景天植物生长海拔高度有关，海拔越高含量越低，我们目前已从PPA中得到8种化合物(另文报道)，未发现红景天甙和酪醇的结构，结果也与文献报道吻合。
本文选择p-HAP紫外光谱最大吸收峰值作为测定波长λS，与该波长对应和背景等吸收点波长作为参比波长λR，采用双波长薄层扫描法可同时消除薄层板厚度不均的背景吸收所带来的误差。本课题由国家自然科学基金会资助
参考文献
1 王曙，王峰鹏.红景天植物化学成分研究概述.天然产物研究与开发，1991，4(3)：58～65
2 江纪武.植物药有效成分手册.北京：人民卫生出版社.1986.584
3 王曙.红景天属植物中红景天甙的高效液相色谱分析.药学学报，1992，27(11)：849～852
(1998-11-03收稿 19990524修回), 百拇医药